临床上，全血细胞减少的患者应考虑AA的可能，典型病例一般诊断不难，但不典型病例，如早期病例，临床表现和实验室检查特征尚不明显，或AA合并或叠合其它临床病症，则诊断也可有一定困难。
与其他疾病一样，AA诊断也需要详细询问病史、全面仔细的体格检查以及必要的辅助检查。病史中强调对于职业史，化学、放射性物质接触史的询问，发病前6个月内应用的药物应详细记录。凡临床表现为进行性贫血、出血和易感染倾向，如全血细胞减少，查体无肝、脾、淋巴结肿大，均应考虑AA的可能。儿童和年轻患者的发育迟滞、畸形、皮肤色素沉着、粘膜白斑、指甲营养不良等须怀疑先天性再生障碍性贫血，包括Fanconi贫血和先天角化不良等。
血液学检查对于本病诊断的意义毋庸置疑。外周血应进行全细胞计数，包括网织红细胞计数。骨髓检查应包括骨髓液涂片和骨髓活检，是诊断本病最重要的依据。临床怀疑再生障碍性贫血而骨髓检查不典型者，应多部位多次穿刺和活检。
另外，尚需检查肝功能、病毒学检查、血清叶酸和维生素B12和自身抗体检查等。流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)小克隆以及外周血和骨髓细胞遗传学检测有助于进一步肯定诊断再生障碍性贫血，排除其他临床、实验室表现相似疾患。儿童和50岁以下年轻患者应常规进行二环氧丁烷诱导的染色体脆性试验(DEB试验)以除外Fanconi贫血。
英国血液学标准委员会提出诊断再障应进行以下检查[2]:
(1)全血细胞及网织红细胞计数
(2)外周血涂片检查
(3)儿童需检测HbF%
(4)骨髓穿刺涂片,骨髓活检和骨髓造血细胞染色体检查
(5)年龄小于50岁患者进行外周血细胞染色体断裂分析,以除外范可尼贫血
(6)流式细胞术检测GPI锚联蛋白
(7)GPI锚联蛋白或Ham试验异常者行尿含铁血黄素试验
(8)血清叶酸和维生素B12浓度测定
(9)肝功能
(10)病毒检测，包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、HIV、CMV等
(11)抗核抗体和抗dsDNA
(12)胸部X线检查
(13)腹部超声和超声心动检查
(14)若患者临床特征符合但对免疫抑制治疗无反应，需进行外周血端粒长度检测，或进行端粒相关基因突变分析以除外先天性角化不良症。
AA发生于某些特殊生理、病理情况下，或并发其他疾患，表现也可不典型。如妊娠期AA、肝炎相关AA、席汉综合征并发AA、结核病并发AA等，除贫血、出血、感染外，还表现并发症相关症状、体征和实验室特征，仔细检查不难辨识。